Isolasi,Identifikasi dan Pemurnian Kofein dari Daun The (Theae Folium)

TUJUAN

·         Ekstraksi padat-cair senyawa organik dari simplisia tanaman

·         Ekstraksi cair-cair secara bertahap

·         Kromotografi lapis tipis dan kromatografi lapis tipis preparatif dari senyawa organik

·         Pemurnian hasil isolasi dengan cara sublimasi

DASAR TEORI

            Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut.Ekstraksi  dapat dibedakan menjadi dua: ekstraksi padat-cair dan ekstraksi cair-cair.

Ekstraksi padat-cair

            Ekstraksi padat-cair adalah transfer difusi komponen terlarut dari padatan inert kedalam pelarutnya.Macam-macam cara ekstraksi padat-cair:

·         Maserasi :Metode pengekstaksian serbuk simplisia dengan cara merendam dalam cairan penyari dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada suhu kamar.Metode maserasi sering dimodifikasi dengan cara remaserasi.

·         Perkolasi :Metode pengekstraksian dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperature ruangan.

·         Digesti :Maserasi kinetik dengan pengadukan yang kontinyu pada temperature yang lebih tinggi dari temperature ruangan (kamar),yaitu secara umum dilakukan pada temperature 40-50 C.

·         Refluks :Ekstraksi dengan pelarut pada temperature titik didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relative konstan dengan adanya pendingin balik.

·         Soxhlet :Ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus (alat soxlet) sehingga  terjadi ekstraksi berkesinambungan / kontinyu dengan jumlah pelarut relative konstan dengan adanya pendingin balik.

·         Destilasi :

o   Destilasi sederhana digunakan untuk memisahkan zat cair yang titik didihnya rendah atau memisahkan zat cair dengan zat padat atau minyak.

o   Destilasi Uap Air adalah metode yang popular untuk ekstraksi minyak-minyak menguap (esensial) dari simplisia tanaman.Metode ini diperuntukan untuk menyari simplisia yang mengandung minyak menguap atau mengandung komponen kimia yang mempunyai titik didih tinggi pada tekanan udara normal.

Ekstrasi Cair – Cair

            Ekstraksi cair-cair yaitu suatu proses transfer massa zat terlarut (solut) diantara 2 pelarut yang tidak saling bercampur.Zat yang diekstraksi terdapat didalam cairan berbentuk cair.Tujuan ekstraksi pelarut adalah purifikasi dan pemisahan dua senyawa atau lebih berdasarkan koefisien distribusinya.

Kesempurnaan ekstraksi dipengaruhi oleh PH,macam pelarut,jumlah volume pelarut,dan jumlah ekstraksi yang dilakukan.

Kromatografi

·         Kromatografi Lapis Tipis adalah cara pemisahan zat yang cepat dengan menggunakan zat penjerap serbuk halus yang dilapiskan seba rata pada lempeng kaca atau bahan lain yang sesuai

·         Kromatografi Kertas

·         Kromatografi Kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campurannya.

 

DAUN TEH                                                   DAUN TEH KERING

SISTEMATIKA TANAMAN TEH ( THEAE SINENSIS ) :

• Divisi : Spermatophyta ( Tumbuhan biji )

• Subdivisi : Angiospermae ( Tumbuhan Biji Terbuka )

• Kelas : Dicotyledoneae ( Tumbuhan biji belah )

• Subkelas : Dialypetalae

• Ordo : Guttiferales ( Clusiales )

• Familia : Camilliaceae ( Theaceae )

• Genus : Camellia

• Spesies : Camellia sinensis ; Theae sinensis

• Varietas : Assamica

KANDUNGAN THEAE FOLIUM ( DAUN TEH )

Alkaloid golongan purin antara lain kofein, theofilin dan theobromin. Selain itu juga mengandung polifenol, tannin, asam fenolat, katekin (epikatekin/EC, Epigalat/EG, Epigalokatekin /EGC, Epigalo katekin Galat/EGCG, Quersetin (Soya, Noni.2007) ). Teh berguna untuk antioksidan (katekin), antikanker, mencegah peningkatan kolesterol dalam darah, anti diare (tanin).

Dalam daun teh kofein berada dalam prosentase 2–5 %. Kofein (1, 3, 7 Trimethilxantin) berupa kristal jarum mengkilat warna putih, tidak berbau dan berasa pahit. Kelarutan kofein dalam air (1 : 45,5 suhu 25º C; 1: 5,5 suhu 80º C; 1 : 1,5 suhu 100º C ), dalam alkohol (1 : 22); diklormetan (1:7); CHCL3 (1:6). Berat molekul 194,19 dan titik lebur 235.

 

STRUKTUR DAUN TEH

AKTIVITAS EMPIRIS

Kofein bersifat termostabil sehingga ekstraksi dapat dilakukan dengan cara refluks atau digesti. Penambahan MgO dapat memisahkan kofein dari senyawa – senyawa yang tidak diinginkan misalnya tanin. Jika konsentrasi basa terlalu tinggi dapat merusak kofein menjadi koefeedin. Penambahan asam sulfat untuk mengendapkan MgO yang tidak tersaring dengan menbentuk garam.

Kofein dalam fase cair diekstraksi dengan kloroform karena dalam suasana asam kelarutan kofein dalam kloroform lebih besar dari kelarutan dalam air. Kofein yang terekstraksi dalam kloroform dicuci dengan NaOH untuk menghilangkan warna alaminya juga untuk menetralkan kelebihan H2SO4. Kofein pada manusia mempunyai efek stimulasi SSP, relaksasi otot bronkus dan diuretik.

Ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi ekstraksi, diantaranya (Kirk-Othmer, 1998) :

a. Suhu

Kelarutan bahan yang diekstraksi dan difusivitas biasanya akan meningkat dengan meningkatnya suhu, sehingga diperoleh laju ekstraksi yang tinggi. Pada beberapa kasus, batas atas untuk suhu operasi ditentukan oleh beberapa faktor, salah satunya adalah perlunya menghindari reaksi samping yang tidak diinginkan.

b. Ukuran partikel

Semakin kecil ukuran partikel, semakin besar luas bidang kontak antara padatan dan solven, serta semakin pendek jalur difusinya, yang menjadikan laju transfer massa semakin tinggi.

c. Faktor solven

Kafein biasanya diisolasi dengan ekstraksi menggunakan solven organik, dan kondisi ekstraksi (solven, suhu, waktu, pH, dan rasio komposisi solven dengan bahan) dapat mempengaruhi efisiensi ekstraksi kafein (Perva U et al., 2006).

PRINSIP KERJA

1. Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan pekat atau kering yang diperoleh dengan mengekstraksi zat-zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian rupa sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan.Ekstraksi adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan menggunakan pelarut cair. Ekstraksi merupakan proses penyarian simplisia nabati atau simplisia hewani dengan cara dan pelarut yang sesuai, bebas dari pengaruh cahaya langsung.

Ekstraksi dapat dilakukan berbagai cara :

a. Ekstraksi padat – cair ( Leaching ) adalah :

Transfer difusi komponen terlarut dari padatan inert ke dalam pelarutnya. Proses ini merupakan proses yang bersifat fisik karena komponen trlarut kemudian dikembalikan lagi ke keadaan semula tanpa mengalami perubahan kimiawi. Ekstraksi dilakukan jika bahan yang dimaksud larutnya dalam solvent pengekstrak.

b. Ekstraksi cair – cair adalah :

Suatu proses transfer massa zat terlarut ( solut ) diantara 2 pelarut yang tidak saling campur. Zat yang diekstraksi terdapat di dalam campuran berbentuk cair. Tujuan utama ekstraksi pelarut adalah purifikasi. Purifikasi dapat terjadi jika solut memiliki koefisien partisi besar sedangkan pengotor memiliki koefisien partisi yang lebih rendah. Kegunaan lainnya untuk pemisahan dua senyawa atau lebih berdasarkan koefisien distribusinya, hal ini terjadi jika dua senyawa memiliki sifat kimia sangat berbeda.

2. Kromatografi

Dasar pemisahan: Perbedaan kecepatan migrasi komponennya / senyawa – senyawa yang dibawa oleh fase gerak dan ditahan secara selektif oleh fase diam, yang bertujuan untuk memisahkan senyawa – senyawa dengan waktu yang tidak terlalu lama.

 Metode kromatografi yang dipakai pada pratikum ini antara lain :

a. Kromatografi lapis tipis (KLT) :

Merupakan cara pemisahan zat yang cepat dengan menggunakan bahan berbutir – butir (fase diam) yang ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas/ kaca, logam, atau lapisan lain yang sesuai. Mekanisme pemisahan : adsorpsi dan partisi.

Penilaian kromatogram : angka Rf pada lempeng KLT.

Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf atau x 100. Jika angka hRf > hRf yang dinyatakan , dapat dikatakan kepolaran pelarut harus dikurangi, jika angka Rf < hRf yang dinyatakan, maka komponen polar pelarut harus dinaikkan ( Egon Stahl, 1985 ).

b. Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) :

KLTP masih merupakan metode yang banyak digunakan karena merupakan metode yang sederhana, relatif murah, cepat dan mampu memisahkan sampel antara 1mg – 1 g. KLTP digunakan pada pemurnian tahap akhir dalam prosedur isolasi (tergantung kompleksitas ekstrak), diutamakan untuk pemisahan campuran yang telah dipisahkan sebagian.

3. Sublimasi :

Sublimasi yaitu pemisahan komponen-komponen dalam campuran yang mudah menyublim dengan cara penyubliman melalui pemanasan. Sublimasi dapat dilakukan untuk memisahkan komponen campuran yang mudah menyublim. Dalam hal ini zat yang dapat menyublim adalah kofein.

ALAT DAN BAHAN

_1.        Isolasi

Alat : Beaker glass, corong pisah, corong gelas, beaker glass, pemanas, cawan penguap, klem dan satif.

Bahan : teh kering, MgO/CaO, NaOH, aquadest, CHCL₃

2.      KLT dan KLT Preparatif

Alat : Bak kromatografi, lempeng KLT Silika gel GF₂₅₄, beaker glass, pipa kapiler, kertas saring, papan kromatografi, beaker glass.

Bahan : kofein, metanol, eter, kloroform, Silika gel GF₂₅₄,

3.      Sublimasi

Alat : Cawan penguap, corong gelas, kertas saring, kapas, asbes, kaki tiga

CARA KERJA

1.      Isolasi Kofein

a.      Ekstraksi padat-cair

Masukkan 50 gram serbuk teh kering dalam beaker glass 500 ml, tambahkan 25 gram MgO dan 250 ml air panas. Panaskan dengan lampu spiritus selama 1 jam. Saring panas-panas dengan kain saring. Filtrat ditampung dan tambahkan 25 ml H₂SO₄ 10 % uapkan sampai ⅓ volume semula ( bila terjadi larutan koloidal, saring ).

b.      Ekstraksi cair-cair

Masukkan larutan dalam corong pisah, ekstraksi dengan 3 x 25 ml CHCL₃. Kumpulkan fase CHCL₃, cuci dengan NaOH 10 % ( beberapa tetes ) dan pisahkan dengan corong pisah. Residu berada di atas, ambil ekstrak di lapisan bawah tampung dalam cawan penguap/petri. Cuci residu dengan CHCL₃  15 ml, campur hasil cucian dengan ekstrak bersih.

 Uapkan ekstrak yang didapat sampai kering.

2.      Kromatografi lapis tipis

Larutkan sedikit ekstrak kering dalam 1 ml CHCL₃, totolkan sampel dan standar dengan menggunakan pipa kapiler pada jarak 1 cm dari sisi bawah lempeng KLT. Lapisi bak kromatografi dengan kertas saring. Jenuhkan bak kromatografi dengan fase gerak CHCL₃-metanol ( 1 : 1 ), ditandai dengan kertas saring terbasahi semuanya.

Masukkan lempeng KLT dalam bak kromatografi, elusi hingga pelarut mencapai 1 cm dari sisi lempeng KLT. Angkat lempeng KLT, angin-anginkan hingga kering. Amati noda dan bandingkan dengan standar di lampu UV, hitung harga Rf-nya.

3.      Kromatografi lapis tipis preparatif

Larutkan 2 gram ekstrak kering daun teh dalam kloroform 5 ml. Totolkan 5 ml larutan pada papan kromatografi perlahan-lahan, setiap tahap diikuti dengan pengeringan dengan penyemprotan adara panas. Penotolan dilakukan pada daerah 3 cm dari sisi bawah papan kromatografi dalam bentuk garis melintang.

Ke dalam bak kromatografi yang telah dilapisi kertas saring dimasukkan pelarut kloroform : metanol ( 1 : 1 ), sehinnga tinggi pelarut di dalam bak setinggi 2,5 cm. Diamkan beberapa saat hingga kertas saring dibasahi pelarut.

Masukkan papan kromatografi yang telah ditotoli ke dalam bak kromatogarfi.

Lakukan elusi dengan pelarut CHCL₃-metanol ( 1 : 1 ) dan hentikan elusi bila pelarut telah mencapai daerah sekitar 1 cm dari sisi atas papan kromatografi. Papan kromatografi diangkat dan dikeringkan dengan semprotan udara panas. Ulangi elusi sampai diperoleh pemisahan yang baik ( dua sampai tiga kali elusi ).

Jika pemisahan telah baik, angkat papan dan semprot dengan udara panas.

Amati noda di bawah lampu UV, beri tanda daerah fluorosensi biru. Kerok lapisan pada daerah yang bertanda, hasil kerokan dikumpulkan dan dimasukkan ke dalam labu elenmeyer 100 ml, tambahkan 50 ml CHCL₃, aduk sampai homogen, kemudian disaring, tampung filtrat dalam cawan porselen. Sisa penyaringan dimasukkan dalam labu erlenmeyer kembali dan ditambah 50 ml, saring dan tampung filtrat, kumpulkan dengan filtrat pertama. Uapkan filtrat sampai diperoleh sisa kering Kristal kofein kasar.

Lakukan pemurnian dengan cara sublimasi.

4.      Sublimasi

Masukkan kristal kasar yang diperoleh dalam cawan porselen. Tutup krus dengan corong yang di dalamnya telah diberi kertas saring berlubang-lubang. Tutup ujung corong dan tempatkan kapas basah di sekeliling corong. Panaskan krus dengan lampu spiritus selama kurang lebih lima menit. Krus didinginkan selama 5 menit, kemudian corong dibuka dan kristal kofein hasil sublimasi dikumpulkan, dan ditimbang. Hitung rendemen yang didapat dan tentukan titik lebur kristal yang telah didapat.

PERHITUNGAN

·         Berat sampel daun teh kering :

Berat daun teh kering + plastik           = 36,804 gram

Berat plastik                                         = 0,990 gram –

Berat sampel daun teh kering                         = 35,814 gram

·         Metode isolasi / ekstraksi :

Berat zat yang di dapat metode isolasi/ ekstraksi:

Berat beker glass + zat                        = 62,589 gram

Berat beker glass                                 = 62,363 gram –

Berat zat                                               = 0,226 gram

·         Metode kromatografi lapis tipis :

Fase gerak                        : methanol : CHCL₃ (1:1/ 5ml : 5ml)

Fase diam                         : Silica gel

Pereaksi pendeteksi          : Perendaman flouresensi (bercak gelap ), UV 254 nm

Dari hasil elusi KLT didapat :

Berat beaker + ekstrak kering                         =  62,589 gram

Berat beaker + sisa ekstrak yang ditotolkan   =  62,363 gram

Berat sisa ekstrak yang ditotolkan                  =    0,226 gram

Berat ekstrak kering                            =  0,226 gram

Berat sisa ekstrak yang ditotolkan      =  0,133 gram

Berat ekstrak yang ditotolkan             =  0,093 gram

x (jarak yang ditempuh solut) 5,0 cm

y (jarak yang ditempuh eluen sampai tanda batas) 5,4 cm

Perhitungan Rf:

Rf = jarak yang ditempuh solute sampai tanda batas   x 100%

        jarak yang ditempuh eluen sampai tanda batas

     = 4,7 cm  =  0,992

        5,1 cm

HRf     = x 100%

= 0,922 x 100%

            = 92,2 %

           

Sampel	Kode bercak	Rf	Warna noda
			Visual	UV 254 nm	UV 366 nm	Pereaksi
Kafein dari ekstrak daun teh	4,7 cm	0,922	Putih	Ungu	-	-
Standart	4,7 cm	0,922	Putih	Ungu	-	-

Pembacaan pada sinar UV λ = 254 nm menunjukkan adanya senyawa kofein dengan adanya fluoresensi biru keunguan.

Gambar :

·         Kromatografi lapis tipis preparatif

Fase gerak                  : CHCL3 : methanol (1:1/ 20ml:20ml)

Fase diam                   : Silika GF 254

Pereaksi pendeteksi  : Perendaman flouresensi sinar UV 254 nm

Dari hasil percobaan metode KLTP didapatkan :

Berat erlenmeyer + kerokan          =  65,28 gram

Berat erlenmeyer kosong              = 63,72gram -

Berat kerokan                                =  1,56   gram

·         Hasil sublimasi

a.       Organoleptis : Kristal putih mengkilat seperti jarum.

b.      Data

Berat daun teh	Berat ekstrak kering	Berat hasil kerokan	Berat hasil sublimasi	Titik lebur
35,814 gram	0,226 gram	1,56 gram	0,015 gram

Pemurnian zat :

Berat plastik + kristal              =  0,492 gram

Berat plastik kosong               =  0,477 gram -

Berat kristal                             =  0,015 gram

Perhitungan Rendemen:

Rendemen ekstrak kofein = ekstrak kristal kasar   x 100%

                                                serbuk teh awal

                                            =  0,226               x 100%

                                                35,814

                                            = 0,63  %

Rendemen kafein kristal   = kristal preparative          x 100%

                                           ekstrak kafein preparative

                                         = 0,015       x 100%

                                            1,56

                                          = 0,96 %

Gambar :

PEMBAHASAN

a. Ekstraksi

Ekstraksi merupakan proses penarikan, pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Praktikum ini, untuk tahap ekstraksi terjadi 2 macam yaitu: ekstraksi padat – cair dan ekstraksi cair – cair.

Ekstraksi padat – cair :

Dilakukan karena bahan yang dikehendaki dapat larut dalam solven pengekstraksi. Ekstraksi serbuk teh dengan aquadest ini termasuk proses digesti (maserasi dengan proses pengadukan kontinyu pada temperatur kamar ) 40ᵒ - 50ᵒ C). Adapun penambahan MgO (bersifat basa) untuk mengikat senyawa selain kofein dan H2SO4 10% pada saat pencampuran filtrat 1 dan 2 bermaksud untuk menurunkan pH (mengasamkan).

Ekstraksi cair – cair :

Pada ekstraksi cair – cair ini, percobaan dilakukan di corong pisah. Filtrat yang di dapat dari ekstraksi padat – cair ditambah CHCL3 25 ml NaOH secukupnya , lalu gojog sampai 15 kali hingga jernih, diamkan sebentar tampung bagian bawahnya . Percobaan diulangi sebanyak 3 x agar hasilnya lebih optimal. Pada penambahan NaOH (secukupnya ) bermaksud untuk menarik sisa asam dan untuk pigmentasi.

b. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Preparatif (KLTP)

Kromatografi Lapis Tipis

Menggunakan pelat alumina (alumina basa pH 10, karena bersifat basa) sebagai fase diam. Fase geraknya methanol : CHCL3 (1:1/ 5ml : 5ml) dijenuhkan dengan kertas saring di dalam  chamber. Penotolan larutan ekstrak dan larutan blangko (kloroform) dengan pipa kapiler arah tegak lurus, setelah ditotolkan dikering anginkan. Selanjutnya dideteksi pada sinar UV λ 254 nm, penandaan dilakukan jika terjadi peredaman (kafein + pelarut merupakan larutan yang tak berwarna, tidak bisa dilihat secara kasat mata, dengan deteksi sinar UV dapat terlihat dengan terdapat noda yang menunjukkan pemisahan antara fase diam dan fase geraknya/ terjadi interaksi sinar dengan indikator).

 Dengan ini, KLT mempunyai keuntungan yaitu:

a.       Waktu pemisahan yang cepat dan serbaguna (dapat digunakan berbagai senyawa tanaman).

b.      Untuk mengetahui kemurnian suatu senyawa (suatu senyawa dielusi dengan eluen beberapa beda polaritas menghasilkan 1 bercak).

c.       Untuk mendeteksi senyawa yang terkandung.

d.      Untuk standarisasi sampel (dengan parameter Rf-nya)

e.       Untuk perhitungan Rf (tanpa satuan) untuk mengetahui :

• Seberapa jauh bercak terelusi (Rf idealnya tidak lebih dari 1 ( 0,2 – 0,8)

• Bagaimana sifat kelarutannya

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Pada KLTP penggunaan cuplikan sampel lebih banyak dari KLT, hasilnya dapat digunakan analisa lanjutan, lempeng kaca yang digunakan adalah ukuran 20cm×20cm. Silika gel GF 254 sebagai fase diam, fase gerak yang digunakan CHCL3 : methanol (1:1) yang dijenuhkan. Penotolan larutan ekstrak secara tegak lurus bentuk pita sampai habis dan cukup dikeringaginkan. Pengamatan/ identifikasi kofein pada UV λ 254 nm, penandaan dilakukan jika terjadi peredaman warna biru violet/ keunguan karena secara teori pada struktur molekul kofein terdapat gugus kromofor/ ikatan terkonjugasi yang menyerap energi sehingga mengalami eksitasi, dimana setelah molekul mengalami eksitasi ke tingkat energi lebih tinggi maka akan kembali ke keadaan semula (ground state) dan memancarkan energi yang terdeteksi oleh instrumen. Lalu dikerok dan masukkan ke Erlenmeyer dan untuk selanjutnya dilakukan tahap sublimasi.

c. Sublimasi

Pada tahap akhir proses ini adalah pemurnian kofein dari daun teh dilakukan dengan cara sublimasi. Tetapi tidak semua senyawa dapat dimurnikan dengan metode sublimasi. Senyawa lain dalam daun teh seperti tannin, katekin, dan golongan polifenol tidak bisa disublimasi, hanya kofein yang dapat dimurnikan dengan cara sublimasi. Pada dasarnya kofein (bersifat non-polar) yang akan disublimasi dilarutkan dalam kloroform (semipolar) sesuai prinsip like-dissolve-like (yang dilarutkan = yang terlarut). Hasil pemurnian yang diperoleh berupa hablur kristal jarum yang mengkilap berwarna putih tidak berbau, berasa pahit dan agak sukar larut dalam air.

KESIMPULAN

Dari percobaan yang telah dilakukan didapat kesimpulan bahwa:

• Daun teh (Theae Folium) kering seberat 35,814 gram dilakukan isolasi kofein dengan metode:

1.  Ekstraksi, diperoleh hasil = 0,226 gram

2.  Kromatografi lapis tipis, diperoleh hasil Rf = 0,992 ( HRf = 92,2 % )

Pembacaan pada sinar UV λ = 254 nm menunjukkan adanya senyawa kofein dengan adanya fluoresensi biru keunguan.

    Kromatografi lapis tipis preparatif, diperoleh hasil =  1,56 gram

Sublimasi didapat hasil:

Kristal kofein 0,015 gram berbentuk hablur kristal jarum, berwarna putih.

Dengan perolehan Rendemen:

1. R terhadap ekstrak kofein = 0,63 %

2. R kafein kristal = 0,96 %

REFERENSI

1.  Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1980. Materia Medika Indonesia. Jilid IV.

2. Kirk-Othmer. 1998. Encyclopedia of Chemical Technology 4th Ed. 10:88.

3. Ponco Rahayu, Mamik.dkk. 2011. Petunjuk Praktikum Fitokimia S1 Farmasi. Universitas Setia Budi. Surakarta.